近日，物创海河实验室、南开大学化学学院陈悦/丁亚辉教授团队联合南开大学药学院张泉教授团队在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表题为“Identification of a Small Molecule as Potential Hypoxia-Selective Agents by Reducing Membrane Localization of ENO1 in Pancreatic Cancer Cells”的研究论文。该研究基于天然产物rakicidin A的结构骨架，采用高效的模块化合成策略，成功设计并合成了34个新型大环缩酚肽类衍生物。通过系统的构效关系（SAR）筛选，化合物10e被鉴定为最优候选分子：它不仅保留了优异的缺氧选择性细胞毒性（HSI = 5.89），还因引入N-甲基哌嗪基团而显著提升了化学稳定性与水溶性，从而克服了天然产物APD药效团因高反应性导致的失活缺陷。
以下内容转载自《药研视角》
研究背景
胰腺癌五年生存率不足11%，其特征性的缺氧微环境驱动肿瘤代谢重编程、侵袭转移及多药耐药，是临床治疗面临的核心挑战。天然产物rakicidin A虽具有显著的缺氧选择性细胞毒性，但其4-氨基-2,4-戊二烯酸酯（APD）药效团反应性过高，导致化学稳定性差、易失活，且分子靶点长期不明，严重制约其成药性。因此，开发稳定性改善、靶点清晰的rakicidin A衍生物，对于缺氧靶向胰腺癌治疗具有迫切需求。
重点内容
研究团队设计并高效合成了34个rakicidin A类似物，通过末端酰胺基团的生物电子等排体替换（酯键、硫醚、砜基等）及N-甲基哌嗪基团对APD药效团的前药式保护，系统优化了稳定性与活性平衡。SAR分析确定化合物10e为最优分子（常氧/缺氧IC₅₀分别为0.177/0.0301 μM，HSI=5.89），其化学稳定性与水溶性较先导化合物32g显著提升。靶点鉴定揭示10e共价结合ENO1的Cys357位点；机制上，10e在缺氧条件下双重抑制ENO1——既阻断其糖酵解酶活性，更关键地抑制其膜转位及与c-MET的相互作用，从而抑制PI3K/AKT通路。体内实验证实10e以20 mg/kg剂量显著抑制胰腺癌移植瘤生长，安全性良好。
研究总结
该研究成功实现了rakicidin A类天然产物从"活性不明、稳定性差"到"靶点清晰、成药性改善"的跨越。核心创新在于首次将ENO1膜定位抑制确立为缺氧选择性抗肿瘤的新策略，突破了传统仅关注酶活性抑制的局限。化合物10e作为共价型ENO1调节剂，为胰腺癌缺氧微环境的精准干预提供了先导分子，也为大环缩酚肽类天然产物的结构优化与靶点驱动药物设计提供了重要研究范式。
01
INTRODUCTION
研究背景
胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率不足11%，其特点是诊断晚、侵袭性转移和严重的多药耐药，发病率与死亡率持续上升；目前治疗手段包括手术切除、放化疗、局部治疗和免疫治疗，但早期症状隐匿且诊断困难，手术切除作为唯一临床治愈手段的疗效大打折扣，亟需新的治疗策略。缺氧是胰腺癌的标志之一，由氧消耗增加与供氧不足失衡所致，缺氧肿瘤微环境通过重编程细胞代谢向糖酵解方向促进肿瘤侵袭、转移、凋亡逃逸、血管生成和多药耐药，同时抑制抗肿瘤免疫应答，因此靶向缺氧微环境是胰腺癌治疗的有前景策略，但目前能有效靶向缺氧条件下胰腺癌细胞的策略有限，亟需发现新的靶点和化合物。Rakicidin A是从Micromonospora sp.分离的大环缩酚肽，对缺氧条件下癌细胞具有选择性抑制作用，其独特的4-氨基-2,4-戊二烯酸酯（APD）结构片段与生物活性相关，但APD片段反应性过高导致分子易失活，稳定性差，且其缺氧选择性细胞毒性的作用机制和分子靶点尚不清楚；本研究旨在通过高效合成路线制备36个rakicidin A类似物，开展结构-活性关系研究，发现最优化合物10e，并阐明其通过共价结合ENO1 Cys357发挥缺氧选择性抗癌活性的机制。
02
RESULTS AND DISCUSSION
①Rakicidin A类似物的合成路线设计与多系列衍生物的制备
研究团队开发了新一代rakicidin A类似物的高效合成路线。首先，基于生物电子等排原理，将第二代类似物32g的末端酰胺键替换为酯键，得到化合物1a，并通过五步反应以25%总收率完成其合成；进一步将末端酰胺替换为硫醚、亚砜或砜基等生物电子等排体，分别获得化合物1b（六步总收率25.4%）、1c（七步总收率19%）、1d（m-CPBA 1.0当量氧化，收率63%）和1e（m-CPBA 2.0当量氧化，收率60%）。为解决此前每个类似物需不同起始原料、合成繁琐的问题，研究团队设计了新的通用合成策略：以天冬氨酸衍生物13为起始原料，经烯丙基化、Boc保护、酯化、SEM脱保护及酰胺缩合等九步反应（总收率13.8%）得到关键中间体12a，再通过酰胺缩合与三步转化高效合成了24个末端胺基不同的类似物10a-o。此外，基于初步筛选出的活性分子10e，进一步设计了甲氧基取代类似物15a/c（总收率分别为2.9%和3.7%）、去甲基类似物15b（九步总收率22%）以及糖基化类似物16a-d和25a-g，分别通过Schmidt糖苷化反应和氨解脱乙酰基等策略完成合成，以探索结构简化、水溶性改善及肿瘤靶向性增强的可能性。
②Rakicidin A类似物的构效关系研究与最优化合物10e的确定
研究团队对合成的34个rakicidin A类似物（1a-e、10a-o、15a-c、25a-g及16a-d）在常氧和缺氧条件下对PANC-1胰腺癌细胞的抗增殖活性进行了评估，并以缺氧选择性指数（HSI，即常氧IC₅₀/缺氧IC₅₀）评价其缺氧选择性。结果表明，引入N-甲基哌嗪基团保护APD药效团的1a保留了抗胰腺癌活性和缺氧选择性（HSI=4.45），但活性弱于第二代化合物32g；在1b-1e亚系列中，砜基类似物1e表现出最优的抑制活性（常氧IC₅₀=0.438 μM，缺氧IC₅₀=0.050 μM）和较高的缺氧选择性（HSI=8.62）。10a-o亚系列中，不同胺基取代的化合物在缺氧条件下IC₅₀范围为0.0301-0.188 μM，HSI范围为3.05-6.21，表明末端酰胺可耐受多种电子效应和空间效应基团；其中10e活性最强（常氧IC₅₀=0.177 μM，缺氧IC₅₀=0.0301 μM，HSI=5.89），且相比前药10b及先导化合物32g，具有更优的效力和显著增强的化学稳定性及水溶性，因此被选定用于后续生物学评价和靶点鉴定。甲氧基取代的15a和15c活性较10e降低，表明rakicidin的甲基不能被甲氧基替代；而15b与10e活性相近，说明C-4位手性甲基对活性影响较弱。11个糖基化类似物中，APD结构域糖基化的活性显著优于分子末端糖基化。
③化合物10e对胰腺癌细胞增殖的缺氧选择性抑制作用
研究团队通过MTT实验和克隆形成实验进一步验证了化合物10e对胰腺癌细胞的缺氧选择性细胞毒性。MTT实验显示，10e对PANC-1细胞的常氧和缺氧IC₅₀分别为0.188±0.064 μM和0.067±0.082 μM，对PaTu8988T细胞分别为0.236±0.085 μM和0.094±0.076 μM，对Capan-2细胞分别为0.171±0.171 μM和0.048±0.014 μM，所有缺氧条件下的IC₅₀均显著低于常氧条件，表明10e在缺氧环境下对胰腺癌细胞增殖的抑制效力明显增强。克隆形成实验结果同样显示，10e在缺氧条件下对PANC-1和PaTu8988T细胞的克隆形成能力具有更好的抑制作用，进一步证明10e对胰腺癌细胞增殖具有缺氧选择性。
④化合物10e对胰腺癌细胞迁移的缺氧选择性抑制作用及EMT程序抑制
研究团队通过划痕愈合实验和Transwell实验评估了10e对胰腺癌细胞迁移的缺氧选择性抑制作用。划痕愈合实验表明，10e在常氧和缺氧条件下均能以剂量依赖性方式显著抑制PANC-1和PaTu8988T细胞的迁移；为排除细胞增殖减少对迁移结果的干扰，研究设置了平行增殖对照组，结果显示缺氧条件下10e对细胞活力的降低幅度（<10%）低于迁移解读的生物学显著阈值，而常氧条件下较高浓度（1 μM）虽观察到适度增殖抑制，但划痕闭合抑制幅度（>50%）远大于增殖降低程度，说明抗迁移效应并非单纯继发于增殖抑制。Transwell实验进一步证实10e在两种氧条件下均能以剂量依赖性方式抑制细胞迁移。Western blot分析显示，10e在常氧和缺氧条件下均能显著上调上皮标志物E-cadherin表达，同时下调间充质标志物Vimentin表达，表明10e有效抑制了上皮-间充质转化（EMT）程序，从而可能阻碍肿瘤进展和转移。
图片来源：ACS
⑤化合物10e探针的设计与合成及原位/体外靶点鉴定策略的建立
为阐明10e的作用靶点，研究团队设计并合成了两种化学探针。首先，从关键中间体12a出发，经TBDPS脱保护、乙基磺酰化及N-甲基哌嗪取代等三步反应（总收率73%）制备了炔基探针10p，其结构仅在10e基础上引入最小化的炔基手柄；活性测试显示10p对PANC-1、PaTu8988T和Capan-2细胞在常氧和缺氧条件下的IC₅₀与10e相当，保留了可比的缺氧选择性。该探针可进入活细胞，在生理条件下与胞内靶点结合，随后通过铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）引入生物素标签，实现"原位靶点鉴定"，该策略保留了天然细胞环境，最小化了裂解液中非特异性相互作用导致的假阳性。其次，合成了预生物素化的探针27（从10p经点击反应制备，收率52%），直接用于细胞裂解液以验证原位鉴定获得的候选靶点，作为互补的正交方法确认10e与靶蛋白的直接结合。两种探针联用，分别用于靶点发现和体外验证。
⑥化合物10e靶向ENO1的靶点鉴定与生物信息学验证
研究团队利用两种探针系统鉴定了10e的靶点蛋白。首先，PANC-1细胞经10p处理后裂解，通过点击反应标记生物素标签，链霉亲和素琼脂糖富集后进行银染，在常氧和缺氧条件下均观察到约50 kDa的特异性条带；预生物素化探针27处理细胞裂解液后同样富集到约50 kDa的特异性条带。LC-MS/MS分析鉴定出ENO1、EF1G、RPL4和SQOR四种潜在靶点蛋白。考虑到10e的缺氧选择性特征，研究团队推测其主要靶点可能与缺氧调控蛋白HIF-1α相关；通过GEO数据库（GSE28735和GSE15471）进行生物信息学分析，发现ENO1与HIF-1α在胰腺癌组织中呈最强的正相关性，提示ENO1可能是介导10e缺氧选择性效应的直接靶点。进一步分析显示ENO1在胰腺癌组织中明显过表达，且与不良总生存期和无病生存期相关，支持ENO1作为胰腺癌潜在治疗靶点的价值。
⑦化合物10e与ENO1 Cys357位点的共价结合验证及功能确证
为验证10e与ENO1的结合，研究团队进行了系列实验。Western blot显示，炔基探针10p在PANC-1和PaTu8988T活细胞中以剂量依赖性方式结合ENO1；预生物素化探针27在细胞裂解液中同样以剂量依赖性结合ENO1。细胞热迁移实验（CETSA）表明10e处理后ENO1蛋白热稳定性显著增加，提示两者直接结合。重组ENO1蛋白与10e的孵育实验显示，结合呈时间依赖性饱和（Kobs=0.0079 min⁻¹）和剂量依赖性（Ki=25.5 μM）特征，暗示共价结合机制。LC-MS/MS分析鉴定出10e处理组中特异性肽段VNQIGSVTESLQACK（m/z=1098.12，MW=2195.24 Da），与对照肽段（m/z=788.90，MW=1576.80 Da）相比，y2⁺至y13⁺碎片离子均出现618.44 Da的质量位移，该增量与10e脱除哌嗪基团后的分子量完全匹配，证实10e共价结合于ENO1的Cys357位点。将Cys357突变为丝氨酸（C357S）或丙氨酸（C357A）后，10e与突变ENO1的结合显著降低。功能实验表明，10e对NC组细胞的增殖抑制显著，而在shENO1、C357S和C357A细胞中该抑制作用明显减弱，证实10e的抗癌活性依赖于其与ENO1 Cys357残基的相互作用。
图片来源：ACS
⑧化合物10e对ENO1酶活性及膜定位的双重抑制机制
研究团队进一步阐明了10e结合ENO1后的下游功能机制。Western blot显示，10e处理后细胞内ENO1蛋白总水平无显著变化，但酶活性检测表明其在缺氧条件下以剂量依赖性方式抑制ENO1酶活性；C357S和C357A突变体的酶活性较野生型显著降低，提示Cys357对ENO1催化功能至关重要。同时，PANC-1和PaTu8988T细胞在缺氧条件下ENO1的mRNA和蛋白表达均较常氧显著上调，表明缺氧激活糖酵解途径为胰腺癌进展提供更多能量。除酶活性抑制外，Western blot分析显示10e在常氧条件下对ENO1的膜分布和胞质分布无明显影响，但在缺氧条件下以剂量依赖性方式抑制ENO1膜定位，该结果经流式细胞术实验进一步确认。上述结果表明，10e通过抑制ENO1酶活性和缺氧选择性阻断其膜转位，协同抑制胰腺癌细胞的增殖与迁移。
图片来源：ACS
⑨化合物10e通过抑制ENO1/c-MET相互作用阻断PI3K/AKT通路
c-MET作为受体酪氨酸激酶，被肝细胞生长因子激活后可驱动癌症进展和转移；既往报道膜定位ENO1可与c-MET相互作用促进LRP5/6磷酸化并激活HGFR/WNT通路。研究团队推测ENO1可能与c-MET直接相互作用促进胰腺癌进展。Co-IP实验证实ENO1在常氧和缺氧条件下均能与c-MET相互作用，且缺氧条件下膜上ENO1和c-MET蛋白表达均明显上调，胞质中ENO1水平也显著升高，提示缺氧信号增强膜定位ENO1和c-MET表达以激活c-MET通路。10e处理后，Co-IP结果显示ENO1与c-MET的相互作用明显减弱；同时，c-MET通路相关蛋白包括p-c-MET、β-catenin、p-β-catenin、AKT、p-AKT和GSK3β的水平均显著降低，而c-MET总蛋白水平无明显变化。上述结果表明，10e通过抑制ENO1/c-MET相互作用，阻断PI3K/AKT信号通路的激活，从而发挥抗肿瘤作用。
图片来源：ACS
⑩化合物10e在胰腺癌异种移植模型中的抗肿瘤活性及PI3K/AKT通路抑制验证
为评估10e的体内抗胰腺癌效果，研究团队构建了PANC-1细胞来源的异种移植瘤模型，随机分为10e治疗组（20 mg/kg，腹腔注射）和对照组。结果显示，10e显著抑制了胰腺肿瘤生长并降低了肿瘤重量。整个观察期间，治疗组小鼠未出现明显毒性体征或行为异常，如嗜睡、蜷缩姿势、毛发竖立等，自发活动水平与对照组相当，表明该治疗具有相对良好的安全性。为验证10e对PI3K/AKT通路的体内调控作用，研究团队进行了免疫组化（IHC）检测，结果显示p-c-MET、β-catenin、AKT、p-AKT和GSK3β的蛋白水平均明显降低，而c-MET总蛋白水平无显著变化，进一步证实10e在体内通过抑制PI3K/AKT通路发挥抗胰腺癌进展作用。
总结与展望
缺氧是胰腺癌等实体瘤的基本特征，驱动代谢重编程、侵袭转移及耐药。Rakicidin A虽具缺氧选择性细胞毒性，但稳定性差、靶点不明。本研究通过结构优化获得衍生物10e，其对PANC-1和PaTu8988T细胞的增殖与迁移抑制活性最优。靶点鉴定揭示10e共价结合ENO1的Cys357；该位点突变后结合亲和力显著下降，证实其为精确靶点。
ENO1在胰腺癌组织中高表达且与HIF-1α强正相关，缺氧条件下两者同步上调，提示HIF-1α激活ENO1以刺激糖酵解。ENO1的抗肿瘤功能与其定位相关：胞质中促进糖酵解，膜定位时激活致癌信号。研究表明，10e不影响ENO1总蛋白水平，但缺氧条件下抑制其酶活性；同时，缺氧上调膜ENO1与c-MET表达，二者相互作用激活PI3K/AKT通路，而10e选择性阻断该膜相互作用及下游信号激活，协同酶活性抑制构成其缺氧选择性疗效。
综上，10e通过共价修饰ENO1 Cys357，双重抑制其酶活性与膜转位，首次将ENO1膜定位抑制确立为缺氧靶向治疗新策略。
